THèSE

présentée par

Alassane WELE

Soutenue le 30 juin 2003

Spectrométrie de masse

I-Principe

La matière à analyser est injectée dans le vide poussé d’une chambre de l’appareil (source d’ions) ou elle est transformée en particules électriquement chargées, les ions.

Dans le cas de spectrométrie de masse à secteur magnétique, ces derniers sont accélérés par un champ électrique puis déviés par un champ magnétique.

On montre que la déviation est proportionnelle à m/z (ici m/e). Un spectromètre de masse est un appareil qui permet de mesurer le rapport masse/charge (m/z) des molécules d’échantillons ionisés. Les performances d’un spectromètre de masse se caractérisent par sa limite de masse, son pouvoir de résolution (aptitude à séparer des ions de masse voisine) et sa sensibilité (la plus petite quantité de matière détectable jusqu’aux traces)

Figure VIII-9 : Schéma simplifié d’un spectrographe de masse à secteur magnétique

II-Mode d’ionisation des peptides (Matthias Mann)

II-1-Ionisation en mode MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation)

(Désorption/Ionisation par Laser Assistée par Matrice)

C’est une méthode d’ionisation douce développée par Karas et Hillenkamp (Karas et Hillenkamp, 1988) vers la fin des années 80. La technique utilise un faisceau laser pulsé pour désorber et ioniser un mélange de matrice/échantillon co-cristallisé et séché sur une surface métallique. Le solide résultant est alors irradié par des impulsions de laser par nanoseconde. La matrice est une petite molécule organique qui absorbe à la longueur d’onde du faisceau laser utilisé. Pour les biomolécules, on utilise exclusivement les dérivés de l’acide cinnamique ou l’acide dihydrobenzoïque (DHB). Ces deux matrices diffèrent par la quantité d’énergie qu’elles transmettent aux molécules biologiques pendant la phase de désorption/ionisation et par conséquent le degré de fragmentation. La matrice « cyano » est plus énergétique que celle DHB, et donne généralement une sensibilité plus élevée. La matrice permet de minimiser la dégradation de l’échantillon provoquée par l’absorption de l’énergie du faisceau laser incident.

Le mécanisme exact du processus d’ionisation MALDI n’est pas complètement connu. Ce processus peut se scinder en quatre étapes :

1)-tri et impact de photons laser,

2)-absorption par la matrice de l’énergie transmise par le laser et ablation des ions et molécules de la surface métallique de la cible,

3)-expansion du nuage éjecté par ablation entraînant les molécules d’échantillons, et ionisation des neutres,

4)-extraction des ions par application d’un champ électrique vers l’analyseur.

L’échantillon est ionisé majoritairement par transfert de protons pour former des ions mono ou multichargés de type [M+nH]n+ où M correspond à la masse moléculaire de la molécule analysée et n au nombre de charges portées par cette molécule ionisée. Toutefois les ions mono chargés [M+H]+ sont majoritaires dans les spectres MALDI des peptides.

La gamme de masse inférieure à 500 daltons (Da) est souvent masquée par les ions matrices secondaires dans le MALDI, ce qui entraîne une perte de sensibilité.

II-2-Ionisation en mode ESI (Electro-Spray Ionisation)

(Ionisation par Electro Nébulisation)

La spectrométrie de masse Electrospray (ESMS) a été développée pour la spectrométrie de masse biologique, par Fenn et coll. (1989). Une solution d’échantillon est introduite dans un capillaire qui est portée à un haut potentiel électrique de l’ordre de 50 eV. Le champ électrique intense appliqué à la sortie du capillaire provoque la formation d’un nuage de gouttelettes chargées qui traversent simultanément un gradient de champ électrique et un gradient de pression dans la direction de l’analyseur du spectromètre de masse. Pendant ce transport la taille des gouttelettes diminue par évaporation du solvant conduisant à des explosions <<coulombiennes>> successives (divisions spontanées de la gouttelette chargée en gouttelettes plus petites, provoquées par une charge surfacique très élevée). Les ions formés à pression atmosphérique sont alors canalisés par un ensemble de skimmers, c’est-à-dire un ensemble d’orifices, vers l’analyseur, dans lequel règne un vide poussé. Ce procédé d’ionisation a lieu en atmosphère et est donc très doux (sans fragmentation des ions du composé analysé). Pour stabiliser le jet, un gaz nébulisateur est souvent utilisé. Ainsi un grand nombre de molécules peuvent être analysées par MS/MS : c’est le cas des protéines, oligonucléotides, sucres et des lipides polaires. Les débits pour l’électrospray sont de l’ordre de 0,5 à quelques microlitres par minute.

Le système nanospray est une version miniaturisée de l’électrospray utilisant des quantités très faibles de soluté de l’ordre du nanolitre par minute.

Les spectres ESI présentent en général un ensemble de pics correspondants aux ions multichargés de type [M+nH]n+.

Figure VIII-10 : Schéma d’une source Electrospray.

III-Les différents spectromètres de masse

Les spectromètres de masse ont connu ces dernières années des avancées technologiques considérables dans l’instrumentation. Les spectromètres de masse mesurent le rapport masse/charge des différents composés analogues ( protéines, peptides ou fragments peptidiques) et de leurs fragments. Trois principes différents peuvent être appliqués pour réaliser la séparation des masses : Séparation sur la base du temps de vol (TOF : Time Of Flight), Séparation par les champs électriques quadripolaires produits par des tiges en métal (spectrométrie de masse quadripolaire) ou Séparation par éjection sélective des ions d’un champ tridimensionnel de piégeage (piége d’ions ou spectrométrie de masse de cyclotron d’ions de transformée de Fourier)

Pour l’analyse structurale, tel le séquençage des peptides, deux étapes de spectrométrie de masse sont exécutées en tandem (spectrométrie de masse en tandem ou MS/MS)

III-1-Spectromètre de masse MALDI-TOF

Les échantillons sont déposés sur un substrat en métal capable de contenir entre un ou plusieurs centaines de taches de composés à étudier. Ces taches sont alors irradiées par une impulsion de laser, pour produire un court éclat d’ions. Les ions sont accélérés par une quantité fixe d’énergie cinétique et voyagent en bas d’un tube de vol. Les petits ions ont une vitesse plus élevée et sont enregistrés sur un détecteur avant les plus grands, produisant le spectre du temps de vol (TOF). La sensibilité de MALDI-TOF est de l’ordre de quelques parties par million de masse et une quantité minimum de une femtomole de peptide est nécessaire pour produire un signal.

III-2-Spectromètre de masse Electrospray-Quadripôle

L’electrospray est le plus souvent combiné à un spectromètre de masse quadripolaire. Le quadripôle est un filtre de masse qui se compose de quatre tiges auxquelles un champ électrique d’oscillation est appliqué et qui laisse passer certaines masses. Les autres masses sont sur la trajectoire instable et n’atteignent pas le détecteur. On obtient ainsi le spectre de masse. Les spectres de masse quadripolaires donnent une résolution de masse de une unité et des mesures de masse exacte de 0,1 à 1Da. Deux quadripôles peuvent être montés sur un spectromètre, ce qui permet d’isoler un peptide donné et d’obtenir un éventail de fragments de masse. Ces dernières années, le triple quadripôle a été complété par un temps de vol. Dans ce cas la troisième section quadripolaire est remplacée par un analyseur en temps de vol. L’avantage de cet instrument, c’est de donner une mesure de masse exacte et une haute résolution caractéristique des appareils à temps de vol.

III-3-Spectromètre à piégeage d’ions ou trappe ionique

Des ions peuvent être également emprisonnés pour l’analyse dans les champs électriques tridimensionnels. Cet analyseur est constitué d’une électrode hyperbolique ayant la forme d’un anneau couvert par deux calottes sphériques. La superposition des tensions continues et alternatives permet d’obtenir une sorte de « quadripôle à trois dimensions » dans lesquels les ions sont gardés captifs sur une trajectoire formant une sorte de huit à trois dimensions. Les ions sont alors soumis aux champs électriques additionnels, qui éjectent une espèce d’ions du piège. Alors l’espèce d’ions restante est réduite en fragments, et ses produits sont analysés. Le grand avantage de la trappe ionique est la possibilité de faire de la MSn. La gamme de masse balayée est m/z = 6000 Da et la résolution maximale est de 0,2 unité de masse. En raison du principe de fonctionnement du piège, on ne peut pas observer les fragments de basse masse. Cet instrument n’est pas très utilisé dans la spectrométrie de masse biologique.

Les tableaux Annexe II-1 à 4 décrivent les ions fragments obtenus pour chacun des peptides analysés en ESI-TOF MS-MS.